2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون ………………………………………………………………………………… 18

2-4- باکتری­های اندوفتیک و کاربرد آن­ها……………………………………………………………………. 21

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی……………………………………………………………………. 21

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن……………………………………………………………………………… 25

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن………………………………………………………………………………………….. 28

2-4-4- انحلال فسفات…………………………………………………………………………………………… 39

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

2-5- باکتری­های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

فصل سوم (مواد و روش­ها)

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

3-1-2-1- نمونه و نمونه­گیری…………………………………………………………………………………….. 59

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

3-2-8- تستMR/VP………………………………………………………………………………………………….63

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

3-3- شناسایی باکتری­های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراجDNA…………………………………………………64

3-3-2- روش استخراجDNAژنومی…………………………………………………………………………… 65

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

فصل چهارم (نتایج و بحث)

4-1- جداسازی باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک 68

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

4-4- بررسی فعالیت آنزیمβ-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

4-4-3- ترکیبات محیطCMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ها……………………………………………………………… 77

4-5-1- آنالیز کیفی محصولاتPCR……………………………………………………………………………78

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

فهرست جداول

عنوان جدول صفحه

جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ…………………………………………………………………………………………5

جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک……………………………………………………………………………………..6

جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی……………………………………………………………………………………….12

جدول2-4. انواع ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………………18

جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن………………………………………………………………………………..28

جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی………………………………………………………………………………….32

جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت………………………………………………………………………..33

جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین………………………………………………………………………….34

جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده…………………………………………………………………..35

جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن……………………………………………………………….39

جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور…………………………………………………………………………….43

جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها……………………………………………………………..50

جدول3-1. شرایطPCR……………………………………………………………………………………………………………….66

جدول3-2. چرخهPCR………………………………………………………………………………………………………………..66

جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA………………………………………………………………………66

جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………68

جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون………………………………………………………………………………………..71

جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium moniliforme………………………………………………………..72

جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium graminearum……………………………………………………..72

جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum…………………………………………………………..72

جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium culmorum…………………………………………………………..72

جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهTricoderma virida………………………………………………………………73

جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهTricoderma harizanum……………………………………………………….73

جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum………………………………………………………73

جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهMacrophomina phaseolina………………………………………………73

جدول4-11. ترکیبات محیطCMCآگار1%……………………………………………………………………………………..76

جدول4-12. نتایجBlast……………………………………………………………………………………………………………..79

فهرست شکل­ها

ی نوشته‌ها

4

1-2 میکرو ارگانیسم های تولید کننده

6

1-3 مکانیسم تنظیم کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز

10

1-4 کلاس های عمومی از ال-آسپاراژیناز

11

1-5 روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز

12

1-6 ویژگی های ساختاری ال-آسپاراژیناز

12

1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز

12

1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز

14

1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

15

1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

17

1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی

18

1-7-1-آنزیم های بومی

18

1-7-1-1 ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی

18

1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا

19

1-7-2 آنزیم اصلاح شدهPEG) -آسپاراژیناز)

20

1-8 کاربرد ال – آسپاراژینازها

22

1-8- 1 مکانیسم عمل به عنوان یک کمک کننده به فرآوری مواد غذایی

23

1-8-2 مکانیسم عمل به عنوان یک دارو

25

1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو

26

1-10 نیمه عمر دارو

26

1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز

27

1-11-1 عوارض ایمونولوژیک

27

1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز

27

1-11-3 سمیت دارو

28

1-12 فارموکینیتیک

29

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده

2_1 تحقیقات انجام شده در ایران و خارج از ایران

32

2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز

32

2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی

34

2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از محیط کشت اختصاصیM₉

37

2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از روش نسلریزاسیون

38

2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات

39

2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش SDS-PAGE

39

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 غربالگری سویه های مولد آنزیم از خاک

42

3-2 جداسازی و کشت باکتری

42

3-2-1 مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک

42

3-2-2 کشت

43

3-3 فعالیت آنزیم

45

3-4 روش های اندازه گیری آمونیاك

45

3-5 مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم

45

3-6 معرف آزمایش

46

3-7 خواندن جذب لوله هایTestوBlank

46

3-8 مراحل کلونینگ

47

3-9 شرح مراحل کلونینگ

48

فصل چهارم: نتایج

4-1 نتایج مربوط به جداسازی

60

4-1-1 نتایج کشت

60

4-1-2 نتایج رنگ آمیزی گرم و تست های بیوشیمیایی

61

4-1-3 نتایج بررسی فعالیت آنزیمی

63

4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته

66

4-1-5 نتایج مربوط به مستعد سازی

66

4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس

66

4-1-7 نتایج تستQuick- check

67

4-1-8 نتایج استخراج پلازمید

68

4-1-9 نتایجPCRتاییدی

69

4-1-10نتایج تعیین توالی نمونه:Bacillus cereus strain

69

4-1-11نتایج تعیین توالی نمونه:Bacillus thuringiensis strain

74

4-1-12 نتایج تعیین توالی نمونه :Oerskovia turbata

79

فصل 5 نتایج

5-1 نتیجه

83

5-2 جمع بندی

83

5-3 محدودیت ها

83

5-4 پیشنهادها

84

منابع

85

فهرست جداول

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم های تولیدکننده آسپاراژیناز	7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن	8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان دهنده فعالیت گلوتامیناز	19
جدول1-4 خواص آنزیم های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده های بومی و اصلاح شده	20
جدول1-5 مقایسه ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی وPEG	29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی	31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت	42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکسPCRبا در نظر گرفتن+n	51
جدول 3-3 شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها	51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ0/2cc	54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله یQuick-check	57
جدول4-1 قطر هاله تشکیل شده توسط سویه ها روی محیط برحسب میلی متر	61
جدول4-2 رنگ آمیزی گرم نمونه های آنزیم مثبت	62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن های بیوشیمیایی نمونه های آنزیم مثبت	63
جدول4-4 جذب نمونه های مولد آنزیم در طول موج 600 نانومتر	64
جدول4-5 جذب نمونه های مولد آنزیم در طول موج 480 نانومتر	72
جدول4-6 نتایج در سطح جنس و گونه	80

فهرست نمودار ها

نمودار 1-1 طبقه بندی عمومی ازآسپاراژیناز	11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر	64
نمودار 4- 2 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر	65

فهرست شکل ها

1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23

1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23

1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23

1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24

1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26

1-13-3-تشخیص بیماریسل در گاو …………………………………………………………………………………………………27

1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27

1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29

1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30

1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30

1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35

1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36

1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39

1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39

1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39

1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA–DNA ……………………………………………………………………………39

1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40

1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40

1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42

1 _16_1_تكنیك های ژنومی كه اساس آنها PCR نمی باشد …………………………………………………………………..42

1_16_1_2_انگشت نگاری DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43

1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50

1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب ها در RFLP………………………………………………………………………..50

1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده)…………………………………………………………………………………………55

2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56

2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58

2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65

فصل سوم (مراحل روش تحقیق)………………………………………………………………………………………………………70

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80

3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفیDNAاستخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

فصل چهارم(نتایج و بحث )…………………………………………………………………………………………………………….104

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی((RFLP…………………………………………………..107

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات)……………………………………………………………………………………………….114

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

فهرست جدول ها

عنوان جدول صفحه

جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8

جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف کندرشدمایکوباکتریای …………….33

جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف سریع الرشدمایکوباکتریایی…..…………… 35

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقده­های لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71

جدول 3-2: لیست مواد مصرفی …………………………………………………………………………………………………………… 72

جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79

جدول 3-4: تست­های تعیین هویت مایکوباکتریوم­ها ………………………………………………………………………………. 81

جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91

جدول 4-1- نمونه­های مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونه­ها ………………………….. 113

 

فهرست شکل ها

ی نوشته‌ها

1-2-3- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA 24

1-3-3- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ 26

1-4- اهداف پایان نامه 31

1-4-1- هدف علمی پایان نامه 31

1-4-2- اهداف جزئی 31

1-4-3- اهداف کاربردی 31

1-5- فرضیه ها 31

1-6- سئوالات 31

1-7- ضرورت انجام تحقیق 32

1-8- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق 32

1-9- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی 32

فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق 34

بررسی متون: 35

فصل سوم :مواد وروشها 39

3-1-مواد و تجهیزات 40

3-1-1-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز: 40

3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز: 41

3-1-3- محیطهای کشت مورد استفاده: 41

3-2-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها 42

3-2-1-تهیه محلول(%25) SDS: 42

3-2-2- محلول EDTA(5/0 مولار): 42

3-2-3-تامپون لیز کننده سلول 42

3-2-4- تامپون TE حاوی RNase 42

3-2-5- بافر(5X)TBE: 42

3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI): 43

3-3- روش انجام طرح: 44

3-3-1- نوع مطالعه: 44

3-3-2-جامعه مورد مطالعه: 44

3-3-3- جمع آوری اطلاعات: 44

3-3-4- انجام امور باکتریولوژیک: 44

3-4- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA 46

3-4-1- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR 46

3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR 50

3-4-3- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR 52

3-4-4-تجزیه و تحلیل داده های VNTR 52

فصل چهارم یافته ها 54

4-1- نمتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها 55

4-2- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی 57

4-3- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR 58

4-4- میزان تنوع الل های VNTR 74

4-5- آنالیز داده ها با استفاده از الگوریتم Minimum Spanning Tree 74

4-6- آنالیز داده های VNTR با استفاده از روش NJ 75

فصل پنجم :بحث ونتیجه گیری 77

5-1- بحث 78

5-2- نتیجه گیری و جمع بندی 91

منابع: 92

چکیده انگلسی 96

فهرست جداول و نمودارها

عنوان صفحه

جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا 8

جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه ها 9

جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی 47

جدول 3-2،مقادیرموردنیازجهت انجام واکنش هایPCRبرای تکثیرلوکوس­هایVNTR 48

جدول 3-3، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2،

SENTR3 و SE-7 49

جدول3-4،برنامه ریزی دستگاه­ترموسایکلرجهت تکثیرلوکوس­هایENTR6وSE-8 49

جدول 3-5، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4 49

جدول 3-6، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-10 50

جدول 3-7، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-6 50

جدول 4-1، در فایل EXCEL 73

جدول 4-2، ضریب تنوع هانتر- گاتسون برای هر لوکوس محاسبه شده 74

نمودار 4-1، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر 56

نمودار 4-2، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر 56

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل 1-1 تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی. 5

شکل1-2 باکتری سالمونلا 6

شکل 1-4مای شماتیک از VNTR ها 23

شکل 1-5 پروفایل اللی 24

شکل 1-6 آنالیز MLVA بوسیله MST 25

شکل 1-7، مزایای MLVA 26

شکل 1-8، مراحل انجام MLVA 27

شکل 4-1، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 53 57

شکل 4-2، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 24 57

شکل 4-3، لوکوس ENTR6 58

شکل 4-4، لوکوس SE4 59

شکل 4-5، لوکوس SE4 60

شکل 4-6، لوکوسSE6 61

شکل 4-7، لوکوس SE6 62

شکل 4-8، لوکوسSE7 63

شکل 4-9، لوکوسSE7 64

شکل 4-10، لوکوسSE8 65

شکل 4-11، لوکوسSE8 66

شکل 4-12، لوکوسSE10 67

شکل 4-13، لوکوسSE10 68

شکل 4-14، لوکوسSENTR2 69

شکل 4-15، لوکوسSENTR2 70

شکل 4-16، لوکوسSENTR3 71

شکل 4-17، لوکوسSENTR3 72

شکل 4-18، آنالیز داده های VNTR با استفاده از الگوریتم MST. 75

شکل 4-22، درختچه ی NJ 76

 

چکیده فارسی :

مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود.سالمونلاانتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی در تهران بر پایه ی روش MLVA.

مواد و روش ها:در این پژوهش، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.

نتایج:10 ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با استفاده از روش MST، 51 ایزوله یسالمونلاانتریتیدیس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با استفاده از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.

بحث و نتیجه گیری:نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تکنیک MLVA، یک روش قدرتمند و آسان می باشد و می توان از این تکنیک در اپیدمی ها ی ناشی ازسالمونلاانتریتیدیس استفاده نمود.

1-4- 4-4 پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین…………………………………………….. 19

1-4-4-5 پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن……………………………………………………………. 19

1-4-4-6 واریانت های میتوکندریایی………………………………………………………………………. 20

1-4-5 نقش آلودگی………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5 عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند………………………………………………………. 21

1-5-1 استروژن ها…………………………………………………………………………………………………………… 21

1-5- 2 آنتی اکسیدان ها و عمکرد آنها………………………………………………………………………… 21

1-5-3 پرهیزهای غذایی………………………………………………………………………………………………….. 22

1-5-4 ورزش……………………………………………………………………………………………………………………. 23

1-6 سیستم RAAS و عملکرد آن……………………………………………………………………………………. 23

1-7 طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان…………………………………………………………….. 25

1-7-1 رنین……………………………………………………………………………………………………………………… 25

1-7-2 آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2…………………………………………………………………. 25

1-7-3 آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2. 26

1-7-4 رسپتورهای 1 و 2………………………………………………………………………………………………. 27

1-8 التهاب و سیستمRAAS…………………………………………………………………………………………….. 29

1-9 واریانت ها در ژن AGT……………………………………………………………………………………………….. 30

1-10 RAAS موضعی……………………………………………………………………………………………………….. 30

1-10-1 RAAS موضعی در قلب……………………………………………………………………………….. 31

1-11 تولید آنژیوتانسین بافتی……………………………………………………………………………………………… 31

1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف )……………………………………….. 31

1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی……………………………………………………………………. 32

1-11-3 تولید آنژیوتانسین در داخل سلول…………………………………………………………………… 32

1-12 تاثیرات RAAS روی سلول های قلبی………………………………………………………………….. 33

1-13 تاثیرات RAAS روی جریان کرونری………………………………………………………………………. 34

1-14 تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان……………………………………………………………… 34

1-15 جداسازی و خالص سازی DNA……………………………………………………………………………… 36

1-16 واکنش زنجیره پلی مراز ……………………………………………………………………………………………. 38

1-16-1 مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز………………………………………………………. 39

1-16-2 طراحی پرایمر ………………………………………………………………………………………………….. 40

1-16-3 دمای اتصال پرایمر ……………………………………………………………………………………………. 41

1-17 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………….. 42

1-18 روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک………………………………………………………………………………… 43

1-19 یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP………………………………………………………………. 44

1-20 تعیین توالی بازهای DNA ………………………………………………………………………………………. 46

1-21 مروری بر مطالعات گذشته…………………………………………………………………………………………… 48

1-22 اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2 فصل دوم : مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-1 مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………… 54

2-2 بافرها و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………… 55

2-2-1 روش تهیه EDTA……………………………………………………………………………………………. 55

2-2-2 روش تهیه الکل 75/…………………………………………………………………………………………… 55

2-2-3 روش تهیه پرایمرها………………………………………………………………………………………………. 55

2-2-4 روش تهیه اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………………….. 55

2-2-5 روش تهیه بافر TBE 10X……………………………………………………………………………… 56

2-2-6 روش تهیه بافر TBE ./5X……………………………………………………………………………… 56

2-2-7 روش تهیه لودینگ بافر PCR…………………………………………………………………………… 56

2-2-8 روش تهیه لودینگ بافر SSCP………………………………………………………………………… 57

2-2-9 روش تهیه محلول NAOH………………………………………………………………………………. 57

2-2-10 روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/………………………………………………………………….. 57

2-3 کیت استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 57

2-4 تکنیک PCR………………………………………………………………………………………………………………… 59

2-4-1 شرایط تکثیر قطعه مورد نظر……………………………………………………………………………… 60

2-4-2 مراحل PCR………………………………………………………………………………………………………. 61

2-5 الکتروفورز ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………… 61

2-6 آنالیز ژل SSCP…………………………………………………………………………………………………………… 62

2-7 آماده سازی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………………………………………… 62

2-8 مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP…………………………………………………………………………………… 63

3 فصل سوم : نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

4 فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………… 72

4-1 نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………. 76

4- 3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………… 77

4-4 مراجع……………………………………………………………………………………………………………………………… 78

عنوان فهرست شکل ها صفحه

شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس……………………………………………………………….. 10

شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C………………………………………………………………………………….. 15

شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS………………………………………………………………………………………. 24

شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS ………………………………………………………………….. 28

شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS …………………………………………………….. 29

شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب……………………………………………………….. 33

شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب………………………………………………………………………………….. 35

شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز…………………………………………………………………………………………………. 40

شکل 1-9 : ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 43

شکل 1-10 : روش SSCP …………………………………………………………………………………………………………….. 46

شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز…. 65

شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………… 66

شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C با استفاده از تکنیک SSCP و تعیین توالی………… 67

شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T……………………………………………………………. 68

شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C…………………………………………………………….. 65

شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M …………………………………………………………………. 66

شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T …………………………………………………………………. 66

شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus… 67

شکل 3-10 : نتیجه Blastn برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus….. 67

عنوان فهرست جداول صفحه

جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2…………………………………………………….. 28

جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف……………………………………………. 45

جدول 2-1 : مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………. 55

جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه………………………………………………………………………………….. 59

جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25………………………………….. 60

چکیده :

آترواسکلروزیس “بیماری اصلیعروق کرونرقلب” بیماری است که بر روی شریانهای بزرگ و متوسط بدن تاثیر میگذارد. انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری از فرآیندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS یک سیستم مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGTنخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.

این مطالعه بر روی دومین اگزون ژنAGT(آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر شده با روش SSCP⁵برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و 4360C>T مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین (M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M) تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسماییAGTو افزایش فشارخون را به همراه دارند.

کلمات کلیدی:آترواسکلروزیس، آنژیوتانسینوژن، PCR-SSCP، موتاسیون، آنژیوتانسین 2، فشار خون بالا