۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

27

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه های موردنیاز برای آزمایش ها به شرح زیر است: 28

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول هایفیبروبلاستانسانی.. 30

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

۲-۲-۲ آماده سازی محیط کشت سلولی.. 30

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره سازی سلول ها 33

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول های منجمد شده. 33

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف.. 34

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 36

۲-۵ اندازه گیری میزان مهاجرت سلولی به روش assay Scratch. 36

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه های RNA.. 40

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

۲-۷-۶ واکنش زنجیره ای پلیمراز 43

۲-۷-7 پرایمر. 43

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

۲-۷-9 Real time PCR. 44

۲-۸ جمع آوری عصاره سلولی.. 46

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین ها به روش بردفورد. 46

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling 47

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها: 49

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

.. 53

۳-۱ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر تکثیر سلول های فیبروبلاست.. 54

۳-۲ بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر درصد بقاء سلول های فیبروبلاست.. 56

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر مهاجرت سلول های فیبروبلاست 57

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون بند ناف بر بیان ژن های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج شده. 62

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

.. 72

4-1 بحث.. 73

4-2 نتیجه گیری.. 79

۴-3 پیشنهاد ها 80

. 81

منابع انگلیسی.. 82

فهرست جداول

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول های پلاکتی (۲۲) 11

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

فهرست اشکال

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل شده در استخراج RNA.. 38

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

شکل 2- 5: RNA استخراج شده بر روی ژل اگاروز. 41

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی بادی ها 50

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف در مقایسه با گروه های کنترل در ۲۴ ساعت 55

. 55

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه های دیگر به جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

. 58

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج شده در گروه های مختلف.. 63

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 67

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR 68

شکل 3- 19: رنگ آمیزی ژل حاوی پروتئین ها 69

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

چکیده

هدف:

بیوتیکها……………………………………………………………………………. 25

1-9-1)اکتینومایستها…………………………………………………………………………………………………………….. 26

1-9-1-1) باکتریSaccharopolyspora erythraea ……………………………………………………………. 30

1-10)تقسیم بندی آنتی بیوتیک ها ……………………………………………………………………………………………. 31

1-10-1) طبقه بندی بر مبنای شباهت عمومی ساختار شیمیایی…………………………………………………… 31

1-10-1-1)ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………… 33

1-10-2) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………. 35

1-10-3)آنتی بیوتیک های بازدارنده سنتز پروتئین………………………………………………………………………..35

1-11)عوامل تعیین کننده حساسیت و مقاومت میکروارگانیسم ها به آنتی بیوتیک ها………………………… 36

1-12)انتخاب آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………………. 37

1-13)موارد کاربرد آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………. 38

1-14)اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-1)تاریخچه و منبع………………………………………………………………………………………………………. 38

1-14-2)ساختمان و ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………. 40

1-14-3)آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین…………………………………………………………………. 42

1-14-4)فعالیت ضد باکتریایی اریترومایسین…………………………………………………………………………….. 43

1-14-5)مکانیسم عمل اریترومایسین……………………………………………………………………………………… 44

1-14-6)کاربردهای اریترومایسین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 45

1-14-7)موارد منع مصرف اریترومایسین………………………………………………………………………………… 48

1-14-8)عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………. 48

1-14-9) انواع در دسترس……………………………………………………………………………………………………. 49

1-15)میکروارگانیسم های صنعتی………………………………………………………………………………………….. 49

1-16)جداسازی و نگهداری میکروارگانیسم ها…………………………………………………………………………. 50

1-17)جداسازی میکروارگانیسم های مناسب از محیط……………………………………………………………….. 51

1-18)کلکسیون های کشت…………………………………………………………………………………………………….. 52

1-19)نگهداری میکروارگانیسم ها…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1)نگهداری در دمای پایین…………………………………………………………………………………………… 53

1-19-1-1) نگهداری روی محیط کشت شیب دار حاوی آگار…………………………………………………….. 53

1-19-1-2)نگهداری با استفاده از روش ژرف انجمادی……………………………………………………………. 54

1-19-1-3)نگهداری در نیتروژن مایع…………………………………………………………………………………….. 55

1-19-2)نگهداری در حالت بدون آب……………………………………………………………………………………. 55

1-19-2-1)نگهداری در خاک……………………………………………………………………………………………….. 56

1-19-2-2)نگهداری در سیلیکاژل…………………………………………………………………………………………. 56

1-19-2-3)نگهداری در سلولز……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-4)نگهداری در آب مقطر…………………………………………………………………………………………. 57

1-19-2-5)نگهداری در روغن……………………………………………………………………………………………… 57

1-19-2-6) لیوفیلیزه کردن…………………………………………………………………………………………………… 58

1-20) محیط کشت تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………………. 59

1-21) نیازهای غذایی میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….. 61

1-21-1) کربن……………………………………………………………………………………………………………………. 62

1-21-1-1) عوامل موثر بر انتخاب منبع کربن…………………………………………………………………………. 62

1-21-2) نیتروژن ……………………………………………………………………………………………………………. 63

1-21-3) هیدروژن و اکسیژن………………………………………………………………………………………………… 65

1-21-4) مواد معدنی…………………………………………………………………………………………………………… 65

1-22) تنظیم کننده های متابولیکی…………………………………………………………………………………………… .66

1-23) ضد کف ها………………………………………………………………………………………………………………… 66

1-24) طراحی و فرمول بندی محیط کشت………………………………………………………………………………. 67

1-25) فرایند تخمیر تولید آنتی بیوتیک …………………………………………………………………………………….68

1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک …………………………………………………………68

1-25-2) بخش های اصلی فرآیند تخمیری……………………………………………………………………………… 68

1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن…………………………………………………………………………… 74

1-25-4) مرحله بذر (Seeding )………………………………………………………………………………………….. 77

1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)…………………………………………………………………………………….. 79

1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………….. 82

1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار…………………………………………………………………………………………. 83

1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتی بیوتیک………………………………………………………………………… 84

1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما………………………………………………………………………………….. 86

1-25-8) تاثیر pH روی متابولیسم سلول………………………………………………………………………………….87

1-25-9) مرحله شناسایی و استخراج محصول………………………………………………………………………… 89

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………… 91

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 97

3-2) معرف های رنگی مورد استفاده ……………………………………………………………………………………… 97

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین……………………………………………………………………. 97

3-3-1) تهیه بافر pH 9.6…………………………………………………………………………………………………….. 97

3-3-2) تهیه بافر pH 4.2…………………………………………………………………………………………………….. 98

3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9.6 و بافر pH 9.6اشباع از کلرفرم…………………………………. 98

3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو…………………………………………………………………………………………… 99

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون……………………………………………………………………………………… 100

3-4-1) محیط اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………….. 100

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………. 103

3-4-2) آزمایش ها با محیط کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین……………………………………………..103

3-4-2-1) مرحله بذر دهی (Seeding)………………………………………………………………………………….. 103

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن ها…………………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )……………………………………………………………………….. 105

3-4-2-1-3)بررسی محیط های کشت از لحاظ آلودگی ( Contamination test )……………………… 106

3-4-2-2) مرحله تخمیر……………………………………………………………………………………………………….108

3-5) میزان اوره اضافه شده به محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………109

3-5-1) اوره………………………………………………………………………………………………………………………..109

3-6) تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها …………………………………………………………………………….113

3-7) روش تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….113

3-8) روش سنجش غلظت اریترومایسین در نمونه های تخمیری………………………………………………..114

3-8-1) روش HPLC……………………………………………………………………………………………………………114

3-8-1-1) مقدمه ای بر کروماتوگرافی…………………………………………………………………………………….114

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک…………………………………………………………………………………………118

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام……………………………………………………………………….119

3-8-1-4) کاربردهای کیفی…………………………………………………………………………………………………..120

3-8-1-5) آنالیز کمی……………………………………………………………………………………………………………120

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی(External Standard)……………………………………………………..120

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition)………………………………………………….. 121

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی(Internal Standard)…………………………………………………………………121

3-8-1-6) نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………….122

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )…………………………………………………………..122

3-8-2-1) سیر تحولی و رشد……………………………………………………………………………………………….122

3-8-2-2) کوماتوگرافی لایه نازک (TLC )…………………………………………………………………………….123

3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک……………………………………………………………………………..125

33-8-3) روش Spectrophotometric……………………………………………………………………………………126

3-8-3-1) با اسپکتروفوومتر آشنا شویم…………………………………………………………………………………..127

3-8-3-2) قانون بیر- لامبرت………………………………………………………………………………………………..128

3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر……………………………………………………………………………………..128

3-8-4) روش Bioassay………………………………………………………………………………………………………129

3-8-4-1) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………….131

3-8-4-2) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………131

3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………132

3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث………………………………………………………………………….132

3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح…………………………………………………………………………………………………….133

3-8-4-4) ایجاد چاهک……………………………………………………………………………………………………….134

3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH……………………………………………………………………………………134

3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….134

3-8-4-7) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………..135

3-8-4-8) اندازه گیری قطر هاله مهار شده……………………………………………………………………………..135

3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده های گمراه کننده……………………………………………………………….136

3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………………136

3-8-5) استخراج اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..137

3-8-5-1)تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………….137

3-8-5-2) تهیه رقت های مایع تخمیر……………………………………………………………………………………139

3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر……………………………………………………………………..139

3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل بلو…………………………………………………..140

3-8-5-5) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل بلو……………………………140

فصل چهارم: نتایج

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم درلیتر آرد سویا برروی پارامترهای مورد نظر در طی تخمیر……………..142

4-1-1 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا برروی pH محیط کشت تخمیر……………………….143

4-1-2 ) بررسی اثرغلظت30 گرم درلیترآردسویا برروی درصد وزن تر بیومس درمحیط تخمیر………….143

4-1-3 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا در میزان تولید اریترومایسین……………………………144

4-1-4)بررسی اثرغلظت30گرم درلیترآردسویابرروی مورفولوژی باکتریerythraea.S……………………..145

4-2)سنجش ومقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی درتمام غلظت ها درطی فرایند تخمیر……………148

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت های مختلف………………………………………………………………148

4-2-2 )سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت های مختلف……………………….149

4-2-3 )سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت های مختلف ………………………….150

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………151

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین…………….151

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین………………………….. 151

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت ………………………………152

4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس…………………………153

4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری…………………………….153

فصل پنجم: بحث و پیشنهادها

تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک ها…………………………………….158

5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین………………159

5-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین…160

5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر…………………………………………162

5-3) رابطه بین رشد باکتریSaccharopolysporaerythraeaو میزان تولید اریترومایسین………..163

5-4) رابطه بین میزان رشد باکتریSaccharopolysporaerythraeaوتغییرات بیومس درطی فرایند تخمیر………………………………………………………………………………………………………………………………….165

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….165

5-5)رابطه بین مورفولوژی سویهSaccharopolysporaerythraeaو تولید اریترومایسین…………….169

5-6) برآورد هزینه ها…………………………………………………………………………………………………………….171

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی سویا دریک bach صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………….172

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا در محیط تخمیر…………………………………………….172

5-6-1-2) استفاده از غلظت بهینه 40% اوره در محیط تخمیر…………………………………………………….173

5-7) پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………….175

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………………..177

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………. 184

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………..185

عنوان فهرست جداول صفحه

جدول (1-1): راهنمای دوزاژ ماکرولیدهای خوراکی…………………………………………………………………..33

جدول (1-2): ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………………..40

جدول(1-3): نقش فیزیولوژیکی عناصر غذایی پرمقدار درون سلول و میزان متوسط مورد نیاز………….61

جدول(1-4 ): مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه……………………………65

جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک…………………………………………………….72

جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروه های باکتریایی………………………………………………………….85

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………….101

جدول(3 -2): ترکیبات محلول میکروالمنت …………………………………………………………………………..101

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ………………………………………………………………………….104

جدول (3-4): محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………………………..108

جدول(3-5): خصوصیات اوره……………………………………………………………………………………………….111

جدول(3-6): آنالیز اوره…………………………………………………………………………………………………………112

جدول(3-7): غلظت های اریترومایسین در حجم های استاندارد اریترومایسین و حجم های مورد نیاز برای

تهیه آن ها……………………………………………………………………………………………………………………………..139

جدول ( 4-1 ) : غلظت های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت های مختلف………………………148

عنوان فهرست نمودارها صفحه

نمودار ( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….144

نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت های مختلف……………………..149

نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر………………149

نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر…………………150

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر………………………151

نمودار(4-8): تغییرات pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر…………………………………………..152

نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره………………………………153

عنوان فهرست اشکال صفحه

شکل (3-1): روش تهیه کلروفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم………………………………………….99

شکل (3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون………………………………………………………….102

شکل (3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون………………………………………………………102

شکل (3-4): فرمول شیمیایی و عکسی از اوره………………………………………………………………………….110

شکل (3-5): روش تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………….113

شکل ( 3-6): نمونه ای از سرسمپلر فیلتردار…………………………………………………………………………….113

شکل (3-7): نمایی از دستگاه HPLC……………………………………………………………………………………..119

شکل (3-8): نمونه ای از یک کروماتوگرام………………………………………………………………………………119

شکل (3-9): نمایی از روش TLC………………………………………………………………………………………….125

شکل (4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر………………………………………………………..145

شکل (4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر………………………………………………………….146

شکل (4-3): مورفولوژی میسلیوم ها در روز هشتم تخمیر…………………………………………………………146

شکل (4-4): مورفولوژی میسلیوم ها در روز دهم تخمیر……………………………………………………………147

شکل (4-5): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر……………………………………………………….147

شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolysporaerythraeaدر روز چهارم تخمیر در

غلظت 40% اوره……………………………………………………………………………………………………………………154

شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز ششم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………..154

شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز هشتم تخمیر در

غلظت 40% اوره………………………………………………………………………………………………………………..155

شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolyspora erythraeaدر روز دهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………155

شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم هایSaccharopolysporaerythraeaدر روز یازدهم تخمیر در

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………156

چکیده فارسی

1-1-2 کلزا و اهمیت اقتصادی آن……………………………………………………………………

5

1-2 تنش خشکی………………………………………………………………………………..

8

1-2-1 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان زراعی……………………………………………….

11

1-2-2 اثر تنش خشکی بر روی کلزا…………………………………………………………………

12

1-2-3- ﺗﺄثیر تنش خشکی بر رشد و فتوسنتز………………………………………………………

14

1-2-4 اثر تنش خشکی روی آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و مالون­دی­آلدهید………………………………

18

1-2-5 ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز…………………………………………….

19

1-2-6 ﺗﺄثیر تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار………………………………………………

21

1-3 کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان…………………………….

21

1-3-1 اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان………………………………………………………….

23

1-3-2 مسیرهای ژن­های کنترل کننده تنش­های غیر­زنده………………………………………………………………………

24

1-4 ژن­های مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………..

24

1-4-1 پروتئین کینازها………………………………………………………………………………………………………………

26

1-4-2 خانواده ژنیMAPK……………………………………………………………………………………………………..

28

1-4-3 ژن حساس به اکسین………………………………………………………………………………….

33

فصل دوم: مواد و روش­ها………………………………………………………………………

34

2-1 شرایط رشد………………………………………………………………………………………………………………….

34

2-1-1 نحوه تیمار­دهی گیاهان…………………………………………………………………………………………………

35

2-1-2 برداشت نمونه……………………………………………………………………………………………………………

35

2-1-2-1 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی……………………………………………..

35

2-1-2-2 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک………………………………………………………………

36

2-2 روش های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی………………………………………………………………………..

36

2-2-1 پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA ………………………………………………………….

36

2-2-2 استخراج RNA از بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………………

36

2-2-3 اندازه­گیری میزان غلظت RNA و رقیق سازی نمونه­ها…………………………………………………………………..

37

2-2-4- روش تهیه cDNA………………………………………………………………………………………………

37

2-2-5- واکنش RT-PCR………………………………………………………………………………………………

38

2-2-6 تهیه ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………..

38

2-2-6-1 تهیه TBE 5X…………………………………………………………………………………………………

38

2-2-7 پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………….

38

2-3 روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………

38

2-3-1 طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز…………………….

39

2-3-1-1 اندازه­گیری فعالیت آنزیم آسكوربات پراكسیداز(APX)………………………………………………………

39

2-3-1-2 اندازه­گیری فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز(GPX)………………………………………………………..

39

2-3-2 سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………………………………………..

40

2-3-3 اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)……………………………………………………………………………….

40

2-3-4 اندازه­گیری پروتئین کل…………………………………………………………………………………………………………….

41

2-3-5 اندازه­گیری قندهای محلول………………………………………………………………………………………………………………….

41

2-4 آنالیزهای آماری…………………………………………………………………………………………………………………………..

42

فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………….

43

3-1 نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی…………………………………………………………………………….

43

3-1-1 بررسی بیان ژنProtein Kinaseتحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)………………………….

45

3-1-2 بررسی بیان ژنMAPK4تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)…………………………………….

46

3-1-3 بررسی بیان ژنMAPK3تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)…………………………………….

48

3-1-4 بررسی بیان ژنAuxin responsive proteinتحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا(B.napus)……………

49

3-2 بررسی نتایج حاصل از آزمایشات فیزیولوژیکی…………………………………………………………………………………………….

49

3-2-1 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پر­اکسیداز (GPX) درگیاه کلزا………………………………

50

3-2-2 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) درگیاه کلزا……………………………..

52

3-2-3 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) درگیاه کلزا……………………………………………..

53

3-2-4 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان مالون­دی­آلدهید (MDA) درگیاه کلزا…………………………………………………

55

3-2-5 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا…………………………………………………………………………..

55

3-2-6 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا………………………………………………………………………

57

فصل چهارم: بحث و بررسی…………………………………………………………………………………………………………………………….

58

4-1- بررسی های انجام شده در سطح مولکولی……………………………………………………………………………………………………

61

4-2 بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………………………….

66

4-3 نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………..

67

4-4 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….

68

5- ضمائم…………………………………………………………………………………………………………………………………………..

ها……………………………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-4کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………………….. 28

3-1-5 انتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………. 28

3-1-6 محیط کشت ………………………………………………. 28

3-1-7 ژل ………………………………………………………………………. 28

3-1-8 مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………………. 28

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………………. 28

3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئینALCAM.. …………………………………………………………………… 34

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر………………………………………………………………………………………………….. 34

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………….. 35

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………… 35

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب……………………………………………………………………………………………….. 35

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده………………………………….. 35

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه……………………………………………………………………………………. 36

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSK حاوی DNA ناحیهV پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 36

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli…………………………………………………………… 38

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 38

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………. 39

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺pBSK حاوی DNA ناحیه Vپروتئین ALCAM………………………………………………… 39

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………. 41

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion………………………………………………………………………………… 42

3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………….. 42

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهV پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………….. 44

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه Vاز ژل……………………………………………………………….. 44

3-5-2 ………………………………………………………………………….. 46

3-5-3 ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………………………… 46

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 47

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………… 48

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………. 48

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ناحیه VپروتئیALCAM……………………………………………………. 49

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج ……….. 51

3-6 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………….. 52

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG…………………………………………………………………………. 52

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page………………………………………………………………. 52

3-6-2-1 محتویات كیت. SDS-page ……………………………………………………………………..53

3-6-2-2روش انجام SDS_page………………………………………………………………… 54

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………… 58

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization…………………………………… 58

4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه …………………………………………… 63

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSKحاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM……………………………………………………….. 65

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM………………………………………………………………………………. 66

4-5 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page………………………….. 69

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث……………………………… 71

نتیجه گیری……………… 83

منابع……………………………………… 84

چکیده انگلیسی………………………………..91

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل1-1. نمای شماتیک از ساختار پروتئینALCAM…………………………………………………………………….. 4

2-1 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیاییALCAM در بافت توموری………………………………………………….. 5

شکل 1-3. اناتومی کولون و رکتوم…………………………………………………………………………………….. 7

شکل1-4 مرحله صفر سرطان کولورکتال……………………………………………………………. 10

شکل1-5 مرحلهƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال…………………………………… 11

شکل1-6 مرحلهƖƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال……………………………………. 11

شکل 1-7 مرحلهA]]] از پیشرفت سرطان کولورکتال………………………… 12

شکل1-8. مرحله. B. ƖƖƖاز گسترش سرطان کولورکتال…………………………………….. 12

شکل 1-9 مکانسیم ناپایداری میکروستلایت………………………………………………………… 18

شکل 1-10 تفاوت های پاتولوژی بین تومورهایی که ناپایداری کروموزومی و میکروستلایت…………………………………………………. 19

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ……………………………………………………………………………….. 29

شکل 3-2.شیکر انکوباتور…………………………………………………………………………………….. 30

شکل 3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 30

شکل 3-4. تانک الکتروفورز (SDS-Page)…………………………………………………………………. 31

شکل 3-5…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………. 31

شکل3-6. سانتریفیوژ اپندورف المان……………………………………………………………………….. 32

شکل 3-7… بن ماری………………………………………………………………………………………………….. 32

شکل 3-8… انکوباتور………………………………………………………………………………………. 33

شکل 3-9 دستگاه تصویرساز ژل………………………………………………………………………….. 33

شکل 3-10 سانتریفوژ یخچال دار. ……………………………………………………………………… 34

شکل 3-11 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز………………………………………………… 39

شکل3-12 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز…………………………………………… 44

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………. 60

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی …………………………….. 60

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………….. 60

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………… 61

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………… 63

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ………………………………………………………….65

شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAناحیهV………………………………………………………………………………. 66

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهVپروتئینALCAM. …………………………………………………………….. 67

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK………………………………………………. 67

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a………………………………………………………….. 68

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه …………………………………….. 69

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه Vدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………. 69

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………. 70

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ………………………………………………………………. 71

فهرست جداول

جدول 1-1 میزان بروز و مرگ ومیر سرطان کولورکتال در ایران و کشور های همسایه ایران در هر صد هزارنفر…………………….. 8

چکیده

مقدمه :

یک گلیکوپروتئین گذرنده از غشا از خانواده ایمنوگلوبولین ها ALCAM مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده می باشد.این پروتئین در گسترش تومورزایی سرطان کولورکتال نقش داشته و به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان عمل می کند.بیان این پروتئین به طور قابل توجهی در سرطان کولورکتال نسبت به بافت نرمال افزایش پیدا می کند

سرطان کولورکتال با 2/1 مورد جدید در سال که منجر به مرگ 600 هزار نفر در سال می شود نزدیک به ⅓ از رایج ترین نوع تومورها را تشکیل می دهند. که از این نظر دومین نوع شایع از سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد.از طرفی با توجه به متاستاز ان به نواحی مختلف بدن همچون کبد و ریه در مراحل پیشرفته بیماری ،تنها در صورتی که در مراحل اولیه تشخیص داده شود قابل درمان می باشد. در این تحقیق ما ناحیه Vپروتئین ALCAM را که به عنوان مهمترین بخش در تعاملات پروتئین نقش دارد جهت سنتز انتخاب نمودیم. پروتئین ALCAM نیز به عنوان مارکر سلول های سرطان کولورکتال ، با توجه به بیان ان در مراحل مختلف از پیشرفت بیماری در سطح سلول های سرطان کولورکتال می تواند به عنوان یک هدف مناسب جهت استفاده از ان در کارهای درمانی مثل ساخت واکسن و یا تهیه کیت تشخیصی برای سرطان کولورکتال مورد استفاده قرار گیرد.

روش کار :

در این تحقیق ابتدا توالی مورد نظر را با استفاده از بانک های اطلاعات ژنی استخراج و سپس به وسیله انالیز

بیو انفورماتیکی توالی مورد نظر جهت بهترین بیان در میزبان مناسب بهینه سازی شد. توالی مورد نظر به روش شیمیایی سنتز و سپس قطعه سنتز شده را در میزبان مناسب با استفاده از فرایند کلونینگ و از طریق وکتور بیانی مناسب انتقال داده شده و تکثیر پیدا کرد.در برسی استفاده از القاگر مناسب بیان ژن ناحیه سنتز شده در میزبان بررسی شد. SDS-pageاستفاده از تکنیک نوترکیب القا و پروتئین مورد نظر با

بحث و نتیجه گیری :

این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبانپروکاریوتیرا دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین ناحیه V را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت کرد.

واژه های کلیدی: سرطان کولورکتال، ژن ناحیهV، انالیز بیوانفورماتیکی ،کلونینگ

فصل اول : مقدمه

1-1پروتئینALCAM(CD166)

یک گلیکوپروتئین گذرنده از غشا از خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛ مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

2-1 ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………… 19

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………… 24

3-1-1 باکتری مورد استفاده……………………………………………………………………………………. 24

3-1-2 پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………….. 24

3-1-3 انزیم ………………………………………………………………………………………. 25

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………… 25

3-1-5 انتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-6 محیط کشت باکتری………………………………………………………………….. 25

3-1-7 ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 25

3-1-8 مواد شیمیایی…………………………………………………………………………. 25

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………… 25

3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه ALCAM.. ………………………………………………………………………………………………… 31

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر…………………………………………………………………………….. 31

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………………………. 32

3-3 سنتز شیمیایی DNA ALCAM………………………………………………………………………………….. 32

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب………………………………………………………………………………………….. 32

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده…………………………………………………………………….. 32

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………….. 33

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSK حاوی DNA پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 33

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………….. 33

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………….. 34

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli………………………………………………………….. 35

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 35

3-4-3 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………………….. 36

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺pBSK حاوی DNAپروتئین ALCAM…………………………………………………………… 36

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 38

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………… 39

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 39

3-5 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………. 39

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه CD166از ژل…………………………………………. 39

3-5-2 لایگیشن……………………………………………………………………………………………………………… 43

3-5-3 ترانسفورماسیون……………………………………………………………………………………………………….. 43

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 44

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………. 45

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………….. 45

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژنپروتئین ALCAM……………………………………………………………. 46

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 48

3-6 بیان پروتئین پروتئین ……………………………………….. 48

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک …………………………………………… 49

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page……………………………………………………………………………………………………………. 49

3-6-2-1 محتویات كیت. SDS-page ………………………………………………………………………………………………………………… 50

3-6-2-2روش انجام SDS_page………………………………………………………………………………………………………………. 51

فصل چهارم: نتایج

4-1نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین پروتئین ALCAM…………………………………………………………. 55

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization……………………………………………………………………………….. 55

4-2 سنتز شیمیایی DNA پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………………….. 60

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSKحاوی DNA پروتئینALCAM…………………………………………………………………………… 62

4-4 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………. 63

4-5 بیان پروتئین پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………….. 66

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث…………………………….. 68

نتیجه گیری…………………………………………. 80

منابع…………………………………. 81

فهرست شکل ها

شکل1-1. ساختار پروتئینALCAM………………………………………………………………………………………………………. 4

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ………………………………………………………………. 26

شکل 3-2.شیکر انکوباتور……………………………………………………………………………………… 27

شکل 3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 27

شکل 3-4…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ………………………………….. 28

شکل3-5. سانتریفیوژ اپندورف المان………………………………………………………………………………………… 29

شکل 3-6… بن ماری…………………………………………………………………………………………………………………………………. 29

شکل 3-7… انکوباتور………………………………………………………………………………………………………………… 30

شکل 3-8 دستگاه تصویرساز ژل……………………………………………………………………………………………………. 30

شکل 3-9 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز……………………………………………………… 36

شکل3-10 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز………………………………………… 41

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…….. 57

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد ازبهینه سازی…………………………………………. 57

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………………………………….. 57

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli…………………………………………58

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………………………………………. 60

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ……………………………………………………………………………………………….62

شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA…………………………………………………………………………………………. 63

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی پروتئینALCAM. ……………………………………………………………………………………… 64

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK…………………………………………………………………………………………. 64

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a……………………………………………………………………………………………. 63

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن………………………………………………………………….. 66

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………………………… 66

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………………………………………………… 67

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ……………………………………………………………………….. 68

چکیده

مقدمه :

سرطان کولورکتال به عنوان چهارمین سرطان شایع در دنیا با برآورد 2/1میلیون مورد جدید در سال می باشد. این سرطان با توجه به متاستاز به نواحی مختلف بدن به خصوص کبد و ریه در مراحل پیشرفت بیماری یکی از کشنده ترین نوع از سرطان های بدخیم می باشد.هم چنین این سرطان رتبه سومین نوع از سرطان های شایع در زنان و پنجمین نوع در میان مردان در ایران درارا می باشد.

CD166 یکی از پروتئین های سطحی سلولهای سرطانی در سرطان کولورکتال است که با سرطانی شدن سلول ها میزان بیان سطحی آن بیشتر می شود. از این جهت می توان از آن به عنوان مارکر مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما برآن شدیم که تا با استفاده از کلون کردن و بیان پروتئین سطحی CD166 زمینه برای استفاده از آن جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیص سرطان کولورکتال فراهم شود.

روش کار :

در این مطالعه ابتدا توالی ژن موردنظر به کمک بانک های اطلاعات ژنی انتخاب شد. سپس توالی موردنظر را آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت. ژن آنالیز شدن به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با استفاده از فرآیند کلوینگ ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستمپروکاریوتیانتقال و تکثیریافت.

در انتها نیز بیان ژن موردنظر را در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین موردنظر به کمک تکنیک sDs-page مورد بررسی قرار گرفت.

بحث و نتیجه گیری :

ژن موردنظر توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین موردنظر را تولید کند.

از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیص سرطان کولورکتال به واسطه ی تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن ، سیستم ایمنی فرد را جهت پیشگیری از ابتلا به سرطان کولورکتال تقویت نمود.

واژه های کلیدی : سرطان کولورکتال ، CD166 ، کلونینگ

فصل اول : مقدمه