1-1-10. فلاونوئیدها……………………………………………………………………………………………… 13

1-1-10-1.خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها……………………………………………………………… 13

1-1-10-2. شیمی گیاه فلاونوئیدها……………………………………………………………………………. 15

1-1-10-3. آپیژنین……………………………………………………………………………………………….. 16

1-1-10-4. فلاوونوئید ها معمولا به روش های زیر عمل می کنند…………………………………….. 16

1-1-10-5. فارماکودینامی فلاونوئیدها……………………………………………………………………….. 17

1-1-10-6. جهش زایی و سمیّت ژنی مصرف زیاد فلاونوئیدها……………………………………….. 17

1-1-11. رادیکال های آزاد……………………………………………………………………………………… 18

1-1-11-1. استرس اکسیداتیو………………………………………………………………………………….. 18

1-1-11-2. واکنش های رادیکال های آزاد………………………………………………………………….. 20

1-1-11-3. تقسیم بندی انواع رادیکال های آزاد…………………………………………………………… 21

1-1-11-4. انواع گونه های رادیکالی اکسیژن و نیتروژن…………………………………………………. 22

1-1-11-5. روش های مختلف تولید گونه های اکسیژن و نیتروژن……………………………………. 22

1-1-11-6. اثر رادیکال های آزاد بر روی چربی ها………………………………………………………. 23

1-1-11-7. سیستم های مقابله با آسیب رادیکال های آزاد………………………………………………. 23

1-2. کبد………………………………………………………………………………………………………………. 24

1-2-1. ساختمان کبد……………………………………………………………………………………………… 24

1-2-2. تشریح و آناتومی کبد……………………………………………………………………………………. 25

1-2-3. بافت شناسی کبد…………………………………………………………………………………………. 27

1-2-4. سلول های كبدی………………………………………………………………………………………….. 27

1-2-5. نقش سیستم لنفاوی در عملکرد کبد…………………………………………………………………. 30

1-2-6. ترمیم بافت در کبد افراد بزرگسال……………………………………………………………………. 31

1-2-7. اعمال ترشّحی و دفع كبد……………………………………………………………………………….. 31

1-2-7-1. متابولیسم و دفع گزنوبیوتیک ها…………………………………………………………………… 32

1-2-8. متابولیسم کربوهیدرات ها………………………………………………………………………………. 33

1-2-9. متابولیسم لیپید ها………………………………………………………………………………………… 34

1-2-10. اختلال هموستاز در بیماری های کبدی…………………………………………………………… 35

1-2-10-1. آنزیم های رها شده از بافت کبدی بیمار……………………………………………………… 36

1-2-10-2. ویژگی بافتی………………………………………………………………………………………… 37

1-2-10-3. توزیع داخل سلولی آنزیم ها……………………………………………………………………. 38

1-2-10-4. فعایت نسبی در کبد و پلاسما………………………………………………………………….. 38

1-2-10-4. مکانیسم آزاد سازی……………………………………………………………………………….. 39

1-2-10-5. سرعت پاکسازی آنزیم ها از پلاسما…………………………………………………………… 40

1-2-11. انواع بیماری های کبد………………………………………………………………………………….. 40

1-2-11-1. مکانیسم ها و الگو های آسیب………………………………………………………………….. 41

1-2-12. آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز (ALT) (GPT) (SGPT) (ALAT)……………………… 42

1-2-13. آنزیم آسپارات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………….. 43

1-2-14. آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………….. 44

1-2-15. پروتئین تام……………………………………………………………………………………………….. 46

1-2-15-1. میزان پروتئین های خون……………………………………………………………………………. 46

1-2-16. اندازه گیری آلبومین پلاسما……………………………………………………………………………. 48

1-2-17. بیلی روبین پلاسما………………………………………………………………………………………. 48

1-2-17-1. بیلی روبین و انواع آن………………………………………………………………………………. 49

1-2-18. وظایف عملی پروتئین های پلاسما…………………………………………………………………. 49

1-2-19. ساخت پروتئین های پلاسما………………………………………………………………………….. 50

1-2-20. ازت اوره خون…………………………………………………………………………………………. 51

1-2-21. کراتینین………………………………………………………………………………………………….. 51

1-3. تتراکلرید کربن و سمّیت آن……………………………………………………………………………….. 53

1-3-1. مکانیسم ها ی فعال سازی متابولیکی تتراکلرید کربن…………………………………………….. 54

1-3-2. پراکسیداسیون چربی ها…………………………………………………………………………………. 56

1-3-3. نقص در ساخت پروتئین………………………………………………………………………………. 57

1-3-4. به هم خوردن تعادل کلسیم……………………………………………………………………………. 57

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1. دستگاه ها و لوازم و تجهیزات مورد استفاده…………………………………………………………….. 60

2-2. تركیبات شیمیایی و مواد مصرفی…………………………………………………………………………. 61

2-3.دستگاه پرکولاتور……………………………………………………………………………………………………………62

2-4. روش تهیه عصارههیدروالکلیگیاه کرفس…………………………………………………………….. 63

2-5. حیوانات مورد استفاده و نحوة نگهداری آنها…………………………………………………………… 65

2-6. گروه بندی حیوانات…………………………………………………………………………………………. 66

2-7. روش دادن عصاره…………………………………………………………………………………………… 68

2-8. روش تجویز دارو……………………………………………………………………………………………. 68

2-9. خونگیری از قلب …………………………………………………………………………………………… 69

2-10. روش تعیین فعالیت آنزیم آسپارتات آمنیوترانسفراز (AST/GOT) و آنزیم الانین آمینوترانسفراز (GPT/ALT)……………… 70

2-11. روش تعیین فعالیت آنزیم الكالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………….. 71

2-12. روش تعیین میزان آلبومین و بیلی روبین در سرم خون………………………………………….. 71

2-12. روشهای تجزیه و تحلیل آماری………………………………………………………………………… 73

فصل سوم: نتایج

3-1. نتایج مربوط به غلظت آنزیم AST در گروه های آزمایشی………………………………………. 75

3-2. نتایج مربوط به غلظت آنزیم ALT در گروه های آزمایشی………………………………………. 78

3-3. نتایج مربوط به غلظت آلکالین فسفاتاز در گروه های آزمایشی……………………………………. 82

3-4. نتایج مربوط به غلظت آلبومین در گروه های آزمایشی………………………………………………. 85

3-5. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین توتال (T.Billi) در گروه های آزمایشی…………………… 88

3-6. نتایج مربوط به غلظت بیلی روبین مستقیم (D.Billi) در گروه های آزمایشی………………… 91

3-7. مقایسه نتایج مربوط به وزن موشهای صحرایی در پایان آزمایش در گروه های آزمایشی…… 93

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1. بحث……………………………………………………………………………………………………………. 98

4-2. نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………….. 107

4-3.پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………. 108

فهرست منابع

منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………………. 110

منابع لاتین………………………………………………………………………………………………………………………….112

Abstract…………………………………………………………………………………………………………. 122

فهرست جداول

جدول2 -1: گروه بندی نمونه ها بر اساس مصرف عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس و تتراکلرید کربن…………………………………….. 66

جدول 3-1 مقایسه میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد………………………………………..76

جدول 3-2: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز……………………………….. 77

جدول 3-3 : مقایسه میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد……………………………………..79

جدول3-4: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصارههیدروالکلی گیاه کرفس بر میزان غلظت آنزیم آلانین آمینوترانسفراز 80

جدول 3-5: مقایسه میانگین غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در گروه کنترل و شاهد…………………………82

جدول 3-6: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز…………………………….. …..83

جدول 3-7: مقایسه میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………………….85

جدول 3-8: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت آلبومین 86

جدول 3-9: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد………………………………..88

جدول3-10: اثر تزریق درن صفاقی(IP) عصاره هیدروالکی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان غلظت بیلی روبین توتال……………………… 89

جدول 3-11: مقایسه میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد…………………………..91

جدول3-12: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان بیلی روبین مستقیم………………………… 92

جدول 3-13: مقایسه میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد……………………………94

جدول3-14: اثر تزریق درون صفاقی(IP) عصاره هیدروالکلی گیاه کرفس با مقادیر مختلف بر میزان وزن………………………… 95

فهرست نمودارها

نمودار (3-1): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST در گروه کنترل و شاهد…………………………76

نمودار (3-2): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم AST……………………………………………….. …………78

نمودار(3-3): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT در گروه کنترل و شاهد………………………….80

نمودار (3-4): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALT ……………………………………………………….81

نمودار(3-5): نتایج مربوط به میانگین غلظت آنزیم ALP در گروه کنترل و شاهد……………………….83

نمودار (3-6): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلکالین فسفاتاز ………………………………………………………84

نمودار(3-7): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین در گروه کنترل و شاهد…………………………………86

نمودار (3-8): نتایج مربوط به میانگین غلظت آلبومین …………………………………………………………………87

نمودار(3-9): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال در گروه کنترل و شاهد………………….89

نمودار (3-10): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین توتال …………………………………………………90

نمودار(3-11): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم در گروه کنترل و شاهد……………..92

نمودار (3-12): نتایج مربوط به میانگین غلظت بیلی روبین مستقیم ……………………………………………….93

نمودار(3-13): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در گروه کنترل و شاهد……………..95

نمودار (3-14): نتایج مربوط به میانگین وزن موش های صحرایی در پایان آزمایش……………………….. 96

فهرست شکل ها

شکل (1-1): گیاه کرفس………………………………………………………………………………………………………………… 7

شکل (1-2-): ساختار فلاونوئیدها………………………………………………………………………………………….. 16

B…………………………………………. 21

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیونفیبروبلاستها………………………………………………………. 22

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول های بنیادی…………………………………. 24

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

2-2-1-3. سایتوکاین ها و کموکاین های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-1. ویژگی های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-3-2. میانجی های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

2-5-3. سیکلو اکسیژناز ها و سنتز پروستانوئید ها………………………………………………………………………………… 36

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

2-6-1. تاریخچه ی هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

2-6-3. گونه های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

2-7-3. نقش های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-4. اثر NO بر رگ های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

2-8. پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

2-9-1-4. هفته ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1. مرحله ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

2-9-2-1-1. میانجی های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین ها و لوکوترین ها……………………………………………………………………………………… 67

2-9-2-2. مرحله ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

2-9-2-3. مرحله ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ ها بر فیبروبلاست ها و میو فیبروبلاست ها………………………………………………………. 71

2-9-3-3. ماکروفاژ ها در مرحله ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

3-2. طرز تهیه ی محلول ها و معرف های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

3-3. کشت سلول های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

3-4. آماده سازی غلظت های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست ها…………………………………………………………………………………….. 93

3-6. رنگ آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

3-7. رنگ آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول ها………………………………………………………………………………………………… 95

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

3-10-1. آماده سازی نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

3-11-1. آماده سازی نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

3-11-2. منحنی استاندارد H₂O₂……………………………………………………………………………………………………….. 98

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

3-12. اندازه گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-2. آماده سازی محلول ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-3. آماده سازی نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

3-13-1. روش های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

3-13-1-1. نیاز های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

3-16. آماده سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

3-17-1. آماده سازی نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110

3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه های بافتی لیز شده…………………………………………. 111

3-18-1. آماده سازی نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………… 111

3-18-2. منحنی استاندارد H₂O₂…………………………………………………………………………………………………….. 111

3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112

3-19. اندازه گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه های بافتی لیز شده……………………………………….. 112

3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت های زخم شده………………………………………………………………………. 113

3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113

فصل چهارم: نتایج

4-1. بررسی میزان حیات سلول ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116

4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT….. 117

4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 118

4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله ی یک روز) 119

4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 121

4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله ی یک روز) 122

4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H₂O₂در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 123

4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H₂O₂در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله ی یک روز) 124

4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 125

4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله ی یک روز)………….. 126

4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش ها در روز های مختلف……………………………………………….. 127

4-12. اثر LPS بر میزان H₂O₂در زخم موش ها در روز های مختلف…………………………………………….. 128

4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش ها در روز های مختلف………………………………………… 129

4-15. نتایج نمونه های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول های فیبروبلاست……………………………………………………… 138

5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایطinvivo…………………………………………………………… 142

5-3. اثر LPS بر میزان NO، H₂O₂و COX-2 در شرایطinvitro………………………………………………… 144

منابع………………………………………………………………………………………………………………..149

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………..162

فهرست جداول

جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135

فهرست نمودارها

نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116

نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117

نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118

نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119

نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120

نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120

نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 121

نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122

نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 123

نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124

نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125

نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126

نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 127

نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 128

نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 129

فهرست اشكال

شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می کند. 14

شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می باشد 15

شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16

شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19

شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28

شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31

شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33

شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور های شبه تول…………………………………………………………… 34

شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید ها……………………………………………………………………………………………… 36

شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40

شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE₂………………………………………………………………………………………………….. 41

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42

شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47

شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48

شکل 2-15. نقش ROS در چرخه ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50

شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52

شکل 2-17. رابطه ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57

شکل 2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58

شكل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک های داخلی فیبروبلاست……………………………………………………….. 60

شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی……………………………………………………………………………………………… 63

شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم……………………………………………………………………………. 65

شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی)……………………………………………………………………………………………… 66

شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ سازی)…………………………………………. 66

شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست ها توسط ماکروفاژها 72

شکل 2-25. اثر سلول های مختلف در ترمیم زخم……………………………………………………………………………… 73

شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول های اپیتلیال…………………. 80

شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن………………………………………………………………………… 84

شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم های سلولی……………………………………………………………………. 94

شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………. 101

شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش های آزمایشگاهی در قفس های مخصوص…………………………………….. 105

شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم………………………………………………………………………………… 107

شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………….. 108

شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم بندی نمونه ها به منظور انتقال به آزمایشگاه های بیوشیمی و پاتولوژی…………….. 109

ترومبین………………………………………………………………………………………………… 21

1-9-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……….. 22

1-10- فیبرینوژن……………………………………………………………………………………………… 23

1-10-1- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز…….. 24

1-11- بازدارنده ی فعال كننده پلاسمینوژن1 (PAI-1)…………………………………………….. 25

1-11-1- ارتباط پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان و ترومبوز……. 27

1-12- اهدف …………………………………………………………………………………………………. 28

فصل دوم: مواد و روش ها

2-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………. 30

2-2- مواد و وسایل لازم جهت انجام آزمایشهای مولکولی ………………………………………… 31

2-3- استخراج DNA از خون…………………………………………………………………………… 33

2-4- بررسی کیفیت و کمیت ژنوم استخراج شده …………………………………………………….. 34

2-4-1- تعیین کیفیت و کمیت ژنوم با استفاده از دستگاه اسپكتروفتومتر نانودراپ …………. 34

2-4-2- تعیین میزان کیفیت ژنوم با استفاده از الکتروفورز ……………………………………….. 36

2-5- واكنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ……………………………………………………………….. 37

2-5-1- مراحل PCR …………………………………………………………………………………… 37

2-6- روش تکثیر متزلزل جهش ها(ARMS-PCR) …………………………………………….. 39

2-7- کنترل داخلی……………………………………………………………………………………………… 41

2-8- تهیه مخلوط PCR ………………………………………………………………………………….. 42

2-9- الكتروفورز……………………………………………………………………………………………… 46

2-9-1- الكتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………………… 46

2-9-2- مواد مورد نیاز برای الكتروفورز با ژل آگارز………………………………………………. 47

2-10- الكتروفورز ژل آگارز بر روی محصولات PCR مورد مطالعه …………………………… 48

2-11- عكس برداری از ژل………………………………………………………………………………… 49

2-12- آنالیز آماری داده ها…………………………………………………………………………………. 49

فصل سوم: نتایج

3-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 51

3-2- اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………………. 52

3-3- بررسی یک عامل خطر در جمعیت مورد مطالعه ……………………………………………… 52

3-3-1- رابطه بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی………………………………………………. 52

3-4- بررسی پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به میوم رحمی …………………… 54

3-4-1- بررسی پلی مورفیسم G20210Aدر پروموتر ژن پروترومبین ………………….. 54

3-4-1-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 55

3-4-2- بررسی پلی مورفیسم -455G/A FGB………………………………………………. 58

3-4-2-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم -455G/A FGB ………………………. 59

3-4-3- بررسی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………………………………… 62

3-4-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G) ……………………… 63

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1- مقدمه …………………………………………………………………………………………………… 67

4-2- بحث …………………………………………………………………………………………………… 68

4-2-1- بررسی ارتباط بین سن و خطر ابتلاء به میوم رحمی……………………………………. 68

4-2-2- ارتباط پلی مورفیسم های مورد مطالعه و خطر ابتلاء به سرطان………………………. 68

4-2-2-1- ارتباط پلی مورفیسم PT G20210A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 68

4-2-2-2- ارتباط پلی مورفیسم FGB-455G/A و خطر ابتلاء به سرطان …………….. 69

4-2-2-3- ارتباط پلی مورفیسم PAI-1 (4G/5G)و خطر ابتلاء به سرطان ………….. 70

4-2-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم های مورد مطالعه ………………………………… 71

4-2-3-1- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PT G20210A ………………………… 71

4-2-3-2- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم FGB-455G/A ……………………….. 73

4-2-3-3- توزیع ژنوتیپی و آللی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) ……………… 74

4-3- نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………. 76

4-4- پیشنهادات……………………………………………………………………………………………… 77

فهرست منابع و مأخذ ……………………………………………………………………………………….. 78

منابع فارسی ……………………………………………………………………………………………………. 78

منابع غیر فارسی…………………………………………………………………………………………………. 78

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………… 92

فهرست جداول

جدول2-1: مواد لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………………………… 31

جدول2-2: دستگاه و وسایل لازم جهت آزمایشهای مولکولی………………………………………… 32

جدول2-3: توالی آغازگرهای به کار رفته در روش ARMS-PCR………………………………. 40

جدول2-4: توالی آغازگرها، به منظور کنترل داخلی……………………………………………………… 41

جدول2-5: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن PT G20210A………… 43

جدول2-6: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن FGB-455G/A…………. 43

جدول2-7: غلظت نهایی اجزای واکنش PCR به منظور تکثیر ژن (4G/5G) PAI-1-675 44

جدول2-8: برنامه PCR جهت تكثیر ژن فاكتور II…………………………………………………….. 44

جدول2-9: برنامه PCR جهت تكثیر ژن β- فیبرینوژن……………………………………………….. 45

جدول2-10: برنامه PCR جهت تكثیر ژن PAI-1……………………………………………………. 45

جدول3-1: اطلاعات مربوط به بیماران میوم رحمی و افراد سالم…………………………………….. 52

جدول3-2: درصد فراوانی بیماری در گروه های مختلف سنی……………………………………….. 53

جدول3-3: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT و خطر ابتلاء به میوم رحمی….. 55

جدول3-4: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم G20210A PT ……………………. 56

جدول3-5: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه G20210A PT در دو گروه بیمار و شاهد…….. 57

جدول3-6: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه -455G/A FGB و خطر ابتلاء به میوم رحمی… 59

جدول3-7: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم FGB-455G/A …………………… 60

جدول3-8: توزیع ژنوتیپی وآللی در ناحیه -455G/A FGB در دو گروه بیمار و شاهد…….. 61

جدول3-9: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 و خطر ابتلاء به میوم رحمی 63

جدول3-10: تجزیه و تحلیل آللی و ژنوتیپی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) ……… 64

جدول3-11: توزیع ژنوتیپی و آللی در ناحیه 4G/5G ژن PAI-1 در دو گروه بیمار و شاهد 65

جدول4-1: توزیع آللی پلی مورفیسم PT G20210A در جمعیت های مختلف …………….. 72

جدول4-2: توزیع آللی پلی مورفیسم FGB-455G/A در جمعیت های مختلف …………….. 74

جدول4-3: توزیع آللی پلی مورفیسم PAI-1-675 (4G/5G) در جمعیت های مختلف ….. 75

فهرست نمودارها

نمودار3-1: با افزایش سن احتمال ابتلاء به میوم رحمی افزایش یافته است…………………………………. 53

فهرست شکل ها

شکل1-1: محل قرار گیری میوم ها در رحم……………………………………………………………….. 7

شکل1-2: نمودار طرح واره هموستاز ……………………………………………………………………… 14

شكل1-3: تشكیل لخته فیبرین……………………………………………………………………………….. 16

شكل1-4: فیبرینولایز…………………………………………………………………………………………… 17

شکل1-5 : موقعیت ژن پروترومبین (11p11)……………………………………………………………………………… 21

…………………………………………………………………………………………… 14

1-3-2-1- باکتری های اسید لاکتیک هموفرمنتاتیو (همگن)……………………………………………………………………. 14

1-3-2-2- باکتری های اسید لاکتیک هتروفرمنتاتیو (ناهمگن)………………………………………………………………… 15 1-4- لاکتوباسیل ها………………………………………………………………………………………………………………………………………… 17

1-5- طبقه بندی لاکتوباسیل ها…………………………………………………………………………………………………………………….. 18

1-6- تاریخچه ی لاکتوباسیل ها ……………………………………………………………………………………………………………………. 19

1-7- محصولات . …………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 20

1-7-1- پنیر …………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-7-1-1- انواع پنیر ……………………………………………………………………………………………………………………………………… 20

1-7-1-2- ارزش غذایی پنیر…………………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-7-2- ماست ………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8- باکتریوفاژ ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 22

1-8-1- نقش باکتریوفاژ در صنایع لبنی شیر ……………………………………………………………………………………………… 24

1-8-1-2- منابع اصلی آلودگی فاژی در کارخانجات صنایع لبنی ………………………………………………………………. 24

1-8-3- اثر باکتریوفاژها ………………………………………………………………………………………………………………………………… 24

1-8-4- تاریخچه کشف باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………………………. 25

1-8-5- مورفولوژی باکتریوفاژ ها ………………………………………………………………………………………………………………… 26

1-8-6- طبقه بندی باکتریوفاژ …………………………………………………………………………………………………………………….. 28

1-8-7- مراحل ورود و تکثیر باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………………. 30

1-8-7-1- مرحله جذب فاژ بر روی سلول باکتری ……………………………………………………………………………………… 30

1-8-7-2- مرحله ورود فاژ به داخل باکتری ……………………………………………………………………………………………….. 31

1-8-7-3- بیوسنتز ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 31

1-8-7-4- رسیدگی کامل …………………………………………………………………………………………………………………………… 31

1-8-8- منشا فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-8-9- سیکل حیاتی فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………………. 32

1-8-9-1- سیکل لیتیک ……………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-8-9-2- سیکل لیزوژنیک ………………………………………………………………………………………………………………………… 32

1-8-10- روش جداسازی فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………… 34

1-8-10-1- روش مستقیم …………………………………………………………………………………………………………………………. 34

1-8-10-1-1-روش های میکروبیولوژی ……………………………………………………………………………………………………. 34

1-8-10-1-2- روش مولکولی ……………………………………………………………………………………………………………………. 34

1-8-10-2 روش غیر مستقیم سنتی …………………………………………………………………………………………………………. 35

1-8-10-2-1- تست فعالیت ……………………………………………………………………………………………………………………… 35

1-8-10-2-2- تست اندیکاتور ………………………………………………………………………………………………………………….. 35

1-8-10-2-3- فلوسایتومتری …………………………………………………………………………………………………………………… 35

1-8-10-2-4- امپدانس الکتریکی یا رسانایی شیر ………………………………………………………………………………….. 35

1-8-10-2-5- سنجش پلاک – لکه و رشد – توربیدومتری ……………………………………………………………………. 36

1-8-10-2-6- انواع PCR ………………………………………………………………………………………………………………………… 37

1-8-10-2-6-1- …..Mutiplex PCR………………………………………………………………………………………………………. 37

1-8-10-2-6-2- Quntitive PCR…………………………………………………………………………………………………………. 37

1-8-10-2-6-3- Traditional PCR ……………………………………………………………………………………………………. 38

1-8-11- کنترل فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 38

1-9- مقاومت انتی بیوتیک …………………………………………………………………………………………………………………………. 40

1-9-1- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک …………………………………………………………………….. 42

1-9-2- انواع مقاومت آنتی بیوتیک ………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-9-3- انتقال ژن های افقی لاکتوباسیل های پروبیوتیک ……………………………………………………………………….. 43

1-9-4- عوام ضد باکتریایی………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

1-9-4-1- آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………………………………………………….. 45

1-9-5- مکانیسم آنتی بیوتیک ها ……………………………………………………………………………………………………………… 45

1-9-5-1- آنتی بیوتیک ها ی ممانعت کننده از سنتز دیواره سلول………………………………………………………… 47

1-9-5-1-1- آنتی بیوتیک های بتالاکتام ………………………………………………………………………………………………… 48

1-9-5-2- مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک بتالاکتام ………………………………………………………………………………… 48

1-9-5-2-1- پنی سیلین ها …………………………………………………………………………………………………………………….. 49

1-9-5-2-2- سفالوسپورین ها و سفامایسین ها ……………………………………………………………………………………….. 50

1-9-5-2-3- گلیکوپپتیدها ……………………………………………………………………………………………………………………….. 51

1-9-5-2-4- پلی پپتید ها ……………………………………………………………………………………………………………………….. 51

1-9-5-2-5- ایزونیازید، اتیونامید، اتامبتول و سیکلوسرین ……………………………………………………………………… 52

1-9-5-3- انتی بیوتیک های مهار کننده سنتز پروتئین ………………………………………………………………………….. 52

1-9-5-3-1- آمینوگلیکوزید ها ………………………………………………………………………………………………………………… 52

1-9-5-3-2- تتراسایکلین ………………………………………………………………………………………………………………………. 54

1-9-5-3-2-1- مقاومت به تتراسایکلین ………………………………………………………………………………………………… 54

1-9-5-3-3- اگزازولیدین ……………………………………………………………………………………………………………………….. 54

1-9-5-3-4- کلرامفنیکل ………………………………………………………………………………………………………………………… 55

1-9-5-3-5- ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………………………….. 55

1-9-5-3-5-1- مقاومت به ماکرولید ها …………………………………………………………………………………………………. 55

1-9-3-6- کلیندامایسین …………………………………………………………………………………………………………………………. 56

1-9-3-7- استرپتوگرامین ……………………………………………………………………………………………………………………… 56

1-9-5-4- آنتی بیوتیک های مهار کننده اسید نوکلوئیک ………………………………………………………………………. 57

1-9-5-4-1- کینولون ها …………………………………………………………………………………………………………………………. 57

1-9-5-4-2- ریفامپین و ریفابوتین ……………………………………………………………………………………………………….. 57

1-9-5-4-3- مترانیدازول ……………………………………………………………………………………………………………………….. 58

1-9-5-4-4- آنتی متابولیت ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 58

1-9-6-1- اهمیت مقاومت آنتی بیوتیک ها در دام ………………………………………………………………………………… 59

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1- تاریخچه ………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

2-2- مطالعات انجام شده در باکتریوفاژ ………………………………………………………………………………………………….. 62

2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها ……………………………………………………………………………………………. 64

فصل سوم: مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز …………………………………………………………………………………………………………………….. 68

3-2- لوازم مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 69

3-3- مواد مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 69

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه ……………………………………………………………………………………………………… 71

3-4-2- آماده سازی محیط های کشت …………………………………………………………………………………………………….. 71

3-4-2-1- محیط های کشت MRS آگار ……………………………………………………………………………………………….. 72

3-4-2-2- محیط های کشت نرم MRS آگار ………………………………………………………………………………………… 72

3-4-2-3- محیط کشت MRS مایع ………………………………………………………………………………………………………. 72

3-5- کشت و آزمایشات تعین هویت باکتری ………………………………………………………………………………………….. 72

3-6- سنجش فاژ ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

3-6-1- روش دو لایه ای پلاک ………………………………………………………………………………………………………………… 73

3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتو UV ………………………………………………………………………………………. 73

3-6-3- آزمون Heap and Lawrence ………………………………………………………………………………………………… 74

3-7- سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ……………………………………………………………………………………… 75

3-7-2- آزمایش تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار ( دیسک دیفیوژن) ….. 76

3-7-2-1- روش انجام آزمایش دیسک گذاری ……………………………………………………………………………………… 76

3-7-2-1-1- تهیه محیط کشت …………………………………………………………………………………………………………… 76

3-7-2-1-2- روش کار ………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

فصل چهارم : نتایج

4-1- شرح مختصری از مطالعه ………………………………………………………………………………………………………………. 80

4-2- نتایج ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 80

4-2-1- نتایج حضور یا عدم حضور فاژ در سویه ها ………………………………………………………………………………… 81

4-2-2- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء UV و میتومایسین C …………………………………………. 83

4-2-3- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با میتومایسین C و Heap and Lawrence ………….. 83

4-2-4- نتایج مشترک جداسازی فاژ در روش القاء با پرتو UV و Heap and Lawrence …………………… 84

4-3- نتایج حساسیت ومقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها …………………………………………………………………. 84

4-4- نتایج میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه ها به آنتی بیوتیک ………………………………………………… 91

4-5-1- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به آمینوگلیکوزید ها 92

4-5-2- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سفالوسپورین ها .. 92

4-5-3- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به گلیکوپپتیدها ……. 93

4-5-4- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به لینکوزامید ها ……. 93

4-5-5- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به ماکرولیدها ………… 94

4-5-6- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به پنی سیلین ها ….. 94

4-5-7- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به کینولون ها ……….. 95

4-5-8- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به سولفانامید ها ……… 95

4-5-9- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به تتراسایکلین ها…….. 96

4-5-10- نتایج الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های لاکتوباسیل بومی نسبت به دیگر آنتی بیوتیک ها……………… 96

فصل پنجم: بحثو نتیجه گیری

5-1- اهمیت جداسازی فاژ ………………………………………………………………………………………………………………………. 99

5-2- نتایج جستجو برای جداسازی فاژ …………………………………………………………………………………………………… 100

5-3- اهمیت الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی پروبیوتیک ها …………………………………………………………………… 102

5-4- راه های انتقال ژن های مقاومت به آنتی بیوتیکی در لاکتوباسیل ها ……………………………………………. 103

5-5- نتایج تفسیر برای الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی ………………………………………………………………………… 104

5-6- پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 109

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 111

ضمائم

پوسترهای ارائه شده در پانزدهمین کنگره بین المللی میکروب شناسی ایران ……………………………………… 121

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………. 12۳

فهرست جداول

جدول 1-1- مورفولوژی باکتریوفاژهای اسید لاکتیک ……………………………………………………………………………… 30

جدول 1-2- گروه های آنتی بیوتیکی و مکانیسم عمل آن ها …………………………………………………………………. 46

جدول 1-3- پنی سیلین ها و طیف اثر آن ها ………………………………………………………………………………………….. 49

جدول 1-4- مثال های انتخابی از سفالوپورین ها و سفامایسین و طیف اثر آن ها …………………………………. 50

جدول 1-5- ماکرولیدها وتتراساسکلین ……………………………………………………………………………………………………. 56

جدول1-6- کینولون ها ……………………………………………………………………………………………………………………………. 57

جدول 3-1- دستگاه های مورد استفاده در تحقیق به همراه مدل آن ها ………………………………………………. 68

جدول 3-2- مواد مورد نیاز در آزماشی به همراه کشور سازنده آن ها ……………………………………………………. 70

جدول 3-3- دیسک های آنتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه ……………………. 75

جدول 4-1- نتایج حضور یا فقدان فاژ در سویه ها با استفاده از 3 روش مختلف ………………………………….. 81

جدول 4-2- نتایج قطر هاله عدم رشد و الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی برای سویه های لاکتوباسیل بومی………. 85

جدول 4-3- میزان درصد حساسیت و مقاومت سویه های به آنتی بیوتیک ………………………………………….. 91

فهرست شکل ها

شکل 1-1- روش تخمیر همولاکتیکی در باکتری های اسید لاکتیک …………………………………………………….. 16

شکل 1-2- تخمیر هترولاکتیکی باکتری های اسید لاکتیک …………………………………………………………………. 17

شکل 1-3- شمای کلی باکتریوفاژ …………………………………………………………………………………………………………… 23

شکل 1-4- سیکل حیاتی لیتیک و لیزوژنیک باکتریوفاژ ………………………………………………………………………… 33

شکل 3-1- پلاک ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 74

شکل 3-2- اندازه گیری هاله عدم رشد …………………………………………………………………………………………………. 78

فهرست نمودارها

4-1- نمودار نتایج مقایسه 3 روش مختلف برای جداسازی فاژ …………………………………………………………….. 83

4-2-1- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به آمینوگلیکوزیدها ………. 92

4-2-2- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به سفالوسپورین ها………. 92

4-2-3- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به ونکومایسین …………… 93

4-2-4- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کلیندامایسین…………. 93

4-2-5- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به اریترومایسین…………. 94

4-2-6- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به پنی سیلین ها ………… 94

4-2-7- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کینولون ها………………….95

4-2-8- الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی سویه های بومی لاکتوباسیل نسبت به کوتریماکسازول ………. 95

-7-2. انواع تست هاى سرولوژیك بروسلوز………………………………….33

2-7-2-1 تست آگلوتیناسیون داخل لوله ای استاندارد………………………………………33

2-7-2-2 تست آگلوتیناسیون ME2……………………………………………………….33

2-7-2-3. تست آنتی گلوبولین یا كمبس رایت………………………………………………34

2-7-2-4. تست فیكساسیون كمپلمان ( ثبوت مکمل )………………………………………34

2-7-2-5و6. تست های رادیوایمونواسی و ELISA…………………………………….34

2-7-2-7. تست رزبنگال………………………………………………………………….34

2-7-3. تشخیص بروسلوزیس بر اساس روش های مولکولی………….34

2-8. آنتی ژن های سطحی……………………………………………..35

2-8-1. لیپوپلی ساکارید(LPS )…………………………………………35

2-8-2. پروتئین غشاء خارجی(OMP)………………………………….38

2-8-3. پورین های عمومی………………………………………………….41

2-9. واکسن های بروسلوز………………………………………………42

2-9-1. واكسن های كونژوگه و طراحی آن ها……………………………………….49

2-9-1-2. انتخاب پروتئین حامل…………………………………………..50

2-9-1-1. انتخاب پلی ساكارید…………………………………………………………..50

2-9-1-3. نسبت پلی ساکارید به پروتئین………………………………….51

2-9-1-4. تهیه ی کونژوگه های ایمونوژن هاپتن–حامل…………………….51

2-9-1-5. پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیکی..52

2-9-1-6. ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………..53

2-9-1-7. جفت شدگی شیمیایی ( اتصال) ……………………………………53

2-9-1-8. EDC یا EDAC …………………………………….54

2-9-1-9. آدپیک اسید دی هیدرازید …………………………………………55

2-9-1-10. كونژوگاسیون به شیوه آمیداسیون………………………………56

3-1. تهیه میکروارگانیسم مورد نظر……………………………………….58

3-2. باز کردن سوش لیوفریزه بروسلا آبورتوس……………………..58

3-3. کنترل سوش لیوفیلیزه از نظرRough و Smooth بودن……..59

3-4. تهیه بیوماس سلولی………………………………………………….60

3-5. استخراج و تخلیص LPS بروسلا آبورتوس S99……………….61

3-5-1. د تو کسیفیه کردن LPS با روش قلیایی…………………………..63

3-5-2. آزمون Novotny…………………………………………………..63

3-6. استخراج و خالص سازی Omp بروسلا آبورتوس RB51……………64

3-6-2. اندازه گیری پروتئین با روش لوری…………………………………..65

3-7. کونژوگاسیون Omp و LPS بروسلا آبورتوس………………………..68

3-8. ستون کروماتوگرافی برای تخلیص کونژوگه………………………..69

3-8-1. مراحل پک کردن ستون کروماتوگرافی……………………….69

3-9. آزمون کنترل کیفی کونژوگه………………………………………71

3-9-1. کنترل تب زایی در خرگوش(in vivo test)……………………71

3-9-2. کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal Toxicity)………..72

3-10. واکسیناسیون و سنجش ایمنی زایی کونژوگه……………………..72

3-11. آزمون بررسی فعالیت باکتری کشی سرم حیوان(سرم باکتریسیدال اسیSBA)……..73

3-11-1. اصول آزمون SBA……………………………………………74

4-1. تعیین میزان LPS خام در نمونه استخراج شده با آزمون نووتنی……77

4-2. تعیین غلظت پروتئین در نمونه Omp بروسلا آبورتوس RB51 به روش لوری………….80

4-3. نتایج کنترل کیفی کونژوگه……………………………………….81

4-6. نتایج بررسی کنترل توکسیسیته غیر عادی(Abnormal toxicity)..82

4-5. نتایج کنترل تب زایی در خرگوش (in vivo test)………………..82

4-7. ارزیابی فعالیت باکتری کشی سرم باکتریوسیدال اسی(SBA)…………..83

فهرست شکل ها

شکل(2-1)- عفونت دریچه قلب توسطB.abortus……………….12

شکل(2-2)بروسلا آبورتوس دارای منشاء گاوی…………………………………………..21

شکل(2-3) بروسلا سوئیس دارای منشاء خوک……………………………………………..22

شکل(2-4) بروسلا سوئیس دارای منشاءموش صحرایی………………………………….23

شکل(2-5) بروسلا سوئیس دارای منشاء پستانداران دریایی……………………………….24

شکل(3-1) کنترل سوش RB51 با استفاده از اکروفلاوین………………………………..60

شکل (3-2)کشت و درو بروسلا…………………………………………………………….61

شکل(3-3):استخراج LPS به روش فنول داغ اصلاح شده……………………………..62

شکل(3-4) کیسه دیالیز کونژوگه Omp+ LPS…………………………………………69